WESTERN BLOT I INNE TESTY

[Eliska]

    Współczesna diagnostyka HIV
We współczesnej diagnostyce HIV wykorzystuje się zarówno testy wykrywające obecność przeciwciał anty-HIV, antygenu HIV jak również wirusowego materiału genetycznego (HIV RNA). Wykonywanie hodowli komórkowych nie znajduje zastosowania w rutynowej praktyce klinicznej. Serologiczne testy anty-HIV tzw. przesiewowe lub skriningowe oparte są na metodach immunoenzymatycznych (EIA-enzyme immunoassay lub ELISA- enzyme linked immunoabsorben assay). Testy potwierdzenia, będące w istocie również testami serologicznymi, wykrywają przeciwciała skierowane przeciwko różnym antygenom HIV i oparte są najczęściej na metodach elektroforetycznych typu Western Blot (rzadziej LIA-line immunoassay). Z uwagi na większą liczbę wykrywanych przeciciwciał anty-HIV, koniecznych dla uznania wyniku badania jako pozytywnego, testy Western Blot w porównaniu do EIA cechuje wyższa swoistość. Jednocześnie są one mniej czułe (względem testów III generacji EIA) , co uzasadnia wykonanie testu przesiewowego jako pierwszego lub weryfikację wyniku wykonaniem badania molekularnego (HIV RNA) . Interpretacja testów potwierdzenia uzależniana jest od liczby i typów stwierdzanych przeciwciał. Wynikiem pozytywnym testu określa się zwykle reaktywność (obecność prążków na błonie nitrocelulozowej) względem przeciwciał skierowanych przeciwko conajmniej dwóm białkom , produktów genów env, gag i/lub pol, przy czym wg kryteriów WHO zawsze muszą być stwierdzane przeciwciała przeciwko białkom env (np. gp 41, gp120, p24, p31.
Przy wykrywaniu niedostatecznej liczby prążków - test określa się jako niejednoznaczny
Brak jakiejkolwiek reaktywności lub obecność prążków niesklasyfikowanych oznacza wynik ujemny.
Najczęstszymi przyczynami wyników niejednoznacznych i fałszywie dodatnich testów potwierdzenia należą: współzakażenie wirusowe, obecność przeciwciał heterofilnych przeciwko Ig G (np. mysie, owcze), przeciwmitochondrialnych lub jądrowych, wysoka bilirubinemia i błędy techniczne metody, w tym zanieczyszczenie surowicy.
Białka antygenów wykorzystywane w diagnostyce HIV1/2

Gen wirusa HIV1
env: gp160, gp120, gp41
pol: p66, p51, p31
gag: p55, p24, p17

Gen wirusa HIV2
env: gp140, gp105, gp36
pol: p68, p53, p31
gag: p56, p26, p16

Zasady interpretacji testu potwierdzenia typu Western Blot (wg WHO)
Reaktywność względem białek HIV /prążki /
Wynik dodatni:
2 env ±gag ± env
Wynik nieokreślony:
1 env ±gag ± env
gag + pol
gag
pol
Wynik ujemny:
brak prążków lub prążki niezdefiniowane



    Podstawowe badania w kierunku HIV to metody serologiczne. Z pobranej próbki krwi jest uzyskiwane osocze, następnie dzielone na próbkę 1. i 2.
Wynik dodatni próbki 1. wywołuje konieczność powtórzenia oznaczenia w próbce 2. Wynik dodatni próbki 2. bezwzględnie musi być zweryfikowany testem potwierdzenia.
Wynik dodatni testu potwierdzenia oznacza zakażenie, wynik ujemny testu potwierdzajacego nalezy zweryfikować badaniem HIV RNA lub powtórzeniem całej diagnostyki serologicznej po upływie conajmniej 14 dni
W wypadku wyniku dodatniego próbki 1. oraz ujemnego w 2. zaleca się ponowne pobranie krwi i powtórzenie badania. Tu też wskazane jest zachowanie odstepu 14 dni pomiedzy pobraniami krwi
Wynik ujemny próbki 1. traktuje się jako prawdziwy.
W trakcie okienka serologicznego wirus replikuje bardzo intensywnie, ilość kopii wirusa jest najwyższa w całym przebiegu infekcji. Pozwala to na wykrycie zakażenia poprzez wykazanie obecności antygenu p24 HIV.
W tym celu stosuje się testy IV generacji które wykrywaja i przeciwciała i antygen p24, lub ( w Polsce praktycznie nie stosowane na szerszą skalę ) wykrywające jedynie antygen p24.

W uzasadnionych wypadkach, np. wysokiego prawdopodobieństwa zakażenia, zasadne i dopuszczalne jest wykonanie pierwszego diagnozowania testem genetycznym.
Jego wynik uważa się za ostateczny.


Pacjent nie może otrzymać niepotwierdzonego dodatniego wyniku testu przesiewowego. W praktyce reguła ta jest nagminnie łamana, szczególnie, w przypadku kobiet ciężarnych, którym testy wykonuje się ( wbrew zalecanym procedurom ) w I trymestrze ciąży. Testy na obecność przeciwciał wirusa HIV wykonywane ciężarnym, szczególnie w czasie I go trymestru ciąży charakteryzują się bowiem wysokim współczynnikiem występowania błędu tzw fałszywego plusa. Ilość błędnych wyników w tej grupie sięga nawet według niektórych statystyk 8,75%


Kody wykonywanych testów spotykane na wydruku wyników

F87 Wirus/ przeciwciała nabytego niedoboru odporności (HIV) Antygen p24

F88 Wirus/ przeciwciała nabytego niedoboru odporności (HIV) Antygen (ilościowo)

F89 Wirus/ przeciwciała nabytego niedoboru odporności (HIV) Przeciwciała całkowite

F90 Wirus/ przeciwciała nabytego niedoboru odporności (HIV) Przeciwciała (test potwierdzający)

F91 Wirus/ przeciwciała nabytego niedoboru odporności (HIV) Antygen/ Przeciwciała

F92 Wirus/ przeciwciała nabytego niedoboru odporności (HIV) RNA / DNA

[guest258]

 Białka antygenów HIV i odpowiadające im miejsca na pasku testu Western blot oznaczane są literą p (ang. protein białko) lub gp (ang. glicoprotein glikoproteina) i liczbą określającą ich masę cząsteczkową (x 1000). Dzielą się na 3 grupy: glikoproteiny env (ang. envelope otoczka): gp41, gp120, gp160, białka gag (jądrowe): p18, p24/25, p55 i białka pol (endonukleazy – polimerazy): p34, p40, p52, p68.

 Jak napisano w publikacji PODRĘCZNIK DLA LEKARZY I STUDENTÓW "skład antygenów
 w testach WB jest różny, zależny od producenta. Zawsze są to jednak antygeny
 kodowane przez trzy różne regiony."

[guest258]

W związku z zapytaniem o zródło informacji o testach potwierdzenia.   Informacje są z publikacji dostępnej na stronach Krajowego Centrum ds. AIDS w formacie PDF.


 HIV/AIDS – PODRĘCZNIK DLA LEKARZY I STUDENTÓW, Rozdział III, Janusz J. Stańczak, Diagnostyka laboratoryjna zakażenia wirusem HIV-1 i AIDS, strona 36.
 www.aids.gov.pl/publikacje/108/
 11 maj 2012 - Zawiera informacje dotyczące epidemiologii AIDS, patogenezy zakażenia i diagnostyki laboratoryjnej HIV-1 i AIDS.

 Fragment o testach potwierdzenia zakażenia HIV z tej publikacji:

 "Testy przesiewowe z natury swojej mogą wykazywać wyniki fałszywie
 dodatnie, zależne od np. chorób współistniejących; inną przyczyną, szacowaną
na 0,0005% badań, mogą być wewnątrzlaboratoryjne błędy techniczne.
 Dlatego, zgodnie z regulacjami obowiązującymi również w Polsce,
 dodatni wynik testu przesiewowego winien być zweryfikowany testem potwierdzenia,
 w przeciwnym razie nie może być wydany pacjentowi.
 Testy potwierdzenia wykrywają przeciwciała przeciwko różnym grupom
 antygenów HIV, wykorzystując technologię EIA. Najczęściej stosowane
 są testy WB (western blot), zawierające białka antygenowe zlizowanych
 wirionów HIV-1 lub testy LIA (line immunoassay), zawierające peptydy
 syntetyczne oraz białka uzyskane drogą rekombinacji. Skład antygenów
 w testach WB jest różny, zależny od producenta. Zawsze są to jednak antygeny
 kodowane przez trzy różne regiony: rdzenia (gag – p18, p24, p55),
 polimerazy (pol – p34, p52, p6.) oraz otoczki (env – gp41, gp120, gp160).
 Testy LIA zawierają dodatkowo antygeny otoczki HIV-2 (gp36, sgp105),
 umożliwiające rozróżnienie i wykrycie zakażenia tym wirusem. Te antygeny
 są również obecne w najnowszych wariantach testów WB."

 
  HIV/AIDS – PODRĘCZNIK DLA LEKARZY I STUDENTÓW, Rozdział III, Janusz J. Stańczak, Diagnostyka laboratoryjna zakażenia wirusem HIV-1 i AIDS, strona 37, poniżej:

 "Za wynik dodatni testu potwierdzenia najczęściej, zawsze zgodnie z zaleceniami
 producenta, uznaje się reakcję przeciwciał z co najmniej dwoma
 białkami różnych regionów. Brak jakiejkolwiek reaktywności to wynik
 ujemny. Niepełna reaktywność, reakcja jednego antygenu lub dwu z tej samej
 grupy uważana jest za wynik nieokreślony. Jego przyczyną mogą być
błędy wykonania, ale też wczesna faza serokonwersji, zakażenie HIV-2
 lub innymi retrowirusami.
 W wypadku weryfikacji wyników testów IV generacji testy WB i LIA
 nie są przydatne w pierwszych stadiach zakażenia, przed serokonwersją.
Dlatego przyjęto, że potwierdzenie może być dokonane testami genetycznymi
 identyfikującymi materiał genetyczny HIV lub testem wykrywającym
 antygenemię p24 (w Polsce stosowanym sporadycznie).
 Obecnie stosowane testy serologiczne zapewniają diagnostykę tanią,
szybką, wykazując czułość diagnostyczną i specyficzność bliskie 100%."